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    • 专利摘要:
    Nur wenige Bakterienstämme sind bekannt, die ein Copolymer aus P3HB/4HB synthetisieren. Mit den bekannten Kultivierungsverfahren ist es kaum möglich, maßgeschneiderte Polymere mit definierten Eigenschaften reproduzierbar zu erzeugen, da schon geringe Änderungen des 4HB-Anteils einen großen Einfluß auf die Polymereigenschaften haben. DOLLAR A Es werden spezielle Kultivierungsverfahren zur Produktion von P(3HB/4HB) mit Delftia acidovorans P4a unter Verwendung von Substratmischungen aus Essigsäure und GBL bzw. Butandiol beschrieben, welche die gezielte Einstellung definierter 4HB-Gehalte erlauben. Diese umfassen einerseits fed-batch Verfahren, bei denen die Substratmischungen in Kopplung an die pH-Regulation in kleinen Konzentrationen dosiert werden. Mit diesen Verfahren sind definierte 4HB-Anteile nur in einem eingeschränkten Bereich von 10-13 Mol-% reproduzierbar zu erzeugen. Mit ein- und zweistufigen kontinuierlichen Kultivierungstechniken nach dem Chemostatprinzip kann ein breites Spektrum definiert zusammengesetzter Copolymere mit einem 4HB-Anteil von 2-20 Mol-% hergestellt werden. DOLLAR A Aufgrund ihre mechanischen Eigenschaften, der biologischen Abbaubarkeit und Biokompatibilität sind Biopolymere aus P(3HB/4HB) für viele medizinische Anwendungen, insbesondere das Tissue-engineering, geeignet.
    公开号:DE102004030385A1
    申请号:DE200410030385
    申请日:2004-06-23
    公开日:2006-01-19
    发明作者:Jörg-Uwe Prof. Dr. Ackermann；Gisela Dr. Mothes；Roland Dr. Müller
    申请人:Sachsisches Institut fur Angewandte Biotechnologie Ev (siab)；SAECHSISCHES INST fur ANGEWAN；
    IPC主号:C12P7-62
    专利说明:
    [0001] DieErfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von P(3HB/4HB)mit Delftia acidovorans P4a (DSMZ 10474). Durch eine spezielle Kultivierungkönnendefinierte 4HB-Gehalteim Polymer gezielt und reproduzierbar erzeugt werden.
    [0002] Polyhydroxyalkanoate(PHA) sind natürliche, thermoplastischePolyester, die mit der traditionellen Polymertechnik verarbeitetwerden können.Ein wesentlicher Unterschied zu petrochemisch erzeugten Polymerenbesteht in der biologischen Abbaubarkeit. Der bekannteste und verbreitetsteVertreter dieser Polymergruppe ist Poly(D-3-Hydroxybuttersäure) (PHB).Dieses intrazelluläreSpeicherpolymer kann von einer Vielzahl von Bakterien unterschiedlicher Gattungensynthetisiert werden, wenn eine geeignete Kohlenstoffquelle vorhandenist und die Zellvermehrung durch Limitation von Ammonium-Stickstoff oderPhosphat gehemmt ist (JA Anderson, EA Dawes, 1990, Microbiol. Rev.54: 450-472). Von Nachteil füreine Reihe von Anwendungen ist die geringe Elastizität.
    [0003] Einwesentliche Verbesserung der mechanischen Eigenschaften kann durchdie Synthese von Copolymeren erreicht werden. Von besonderem Interessesind Copolymere aus (D)-3-Hydroxybuttersäure (3HB)und 4-Hydroxybuttersäure(4HB). Schon bei einem 4HB-Gehalt von 3% kann die Reißdehnung von5% auf 45% erhöhtwerden (Y Saito, et al., 1996, Polymer Int. 39: 169-174.).
    [0004] Aufgrundder Biokompatibilitätsind PHA besonders als Werkstoffe für medizinische Anwendungeninteressant (WO 9932 536). In vivo wird das Polymer durch hydrolytische überwiegendnichtenzymatische Spaltung der Esterbindung abgebaut. Die Abbauzeitensowohl von reinem PHB als auch von Copolymeren aus PHB/PHV sindsehr lang und könnenmehr als ein Jahr betragen (O. Duvernoy et al, 1995, Thorac. Cardiovasc.Surgeon 43: 271-274). Füreine Reihe medizinischer Anwendungen sind diese langen Degradationszeitennicht erwünscht. P3HB/4HBzeichnet sich in Abhängigkeitvom 4HB-Anteil im Polymer durch wesentlich kürzerer Abbauzeiten aus, dadie 4HB-Einheiten enzymatisch von Lipasen hydrolysiert werden können (YDoi, 1990, Microbial polyesters. New York: VCH). Die Abbauprodukte3-Hydroxybuttersäure (3HB)und 4-Hydroxybuttersäure(4HB) sind Bestandteil des humanen Stoffwechsels und können weitermetabolisiert werden.
    [0005] Essind nur wenige Bakterienstämmebekannt, die ein Copolymer aus P(3HB/4HB) synthetisieren. Zum gegenwärtigen Zeitpunktsind 5 Wildtyp- Bakterienspecies identifiziert worden, die zur Syntheseeines derartigen Copolymers befähigtsind: Ralstonia eutropha ( JP0633 6523 ), Alcaligenes latus ( JP 06181784 ), Hydrogenophaga pseudoflava(MH Choi et al., 1999, Appl. Envir. Microbiol. 65: 1570-1576), Comamonastestosteronii (G Renner et al., 1996, Food Technol. Biotechnol.34: 91-95) und Comamonas acidovorans ( JP 0919 1893 ). Die Synthese des Copolymerserfolgt nach Zusatz eines zweiten Kohlenstoffsubstrates (4- Hydroxybuttersäure, 1,4-Butandioloder γ-Butyrolacton(GBL) währendder Produktbildungsphase.
    [0006] Mitden bekannten Kultivierungsverfahren ist es kaum möglich, maßgeschneidertePolymeren mit definierten Eigenschaften reproduzierbar zu erzeugen.Schon geringe Änderungendes 4HB-Anteils haben einen großenEinfluß aufdie Polymereigenschaften. Die erzielten PHA-Gehalte sind häufig nichtausreichend, um eine wirtschaftliche Gewinnung der Polymere zu erlauben.Von Nachteil sind zum Teil auch zu niedrige 4HB-Anteile, um signifikanteVeränderungender Material- und Degradationseigenschaften zu erzielen. Die beschriebenenfed-batch Verfahren mit Comamonas acidovorans nutzen komplexe Nährmedienfür dieWachstumsphase (Fleischextrakt, Hefeextrakt, Polypepton), die zumEinleiten der Produktsynthese abgetrennt und durch Stickstoff freieMedien ersetzt werden.
    [0007] Aufgabeder vorliegenden Erfindung war es, Fermentationsverfahren zur wirtschaftlichenHerstellung von P3HB/4HB mit gezielt einstellbarem 4-HB-Anteil zuentwickeln. Die Arbeiten konzentrierten sich auf den Einsatz vonWildstämmen.Im Gegensatz zur Herstellung von PHB-co-4HB mit gentechnisch verändertenEscherichia coli-Stämmen (WO9836078, WO 9914313, WO 9932536, WO 2002008428) kann bei der Verwendungvon Wildstämmenauf den Einsatz von Antibiotika im Fermentationsmedium verzichtetwerden. Außerdemsind Prozeß-und Anlagenkosten aufgrund der geringeren Sicherheitsbestimmungendeutlich verringert.
    [0008] Erfindungsgemäß wird dieAufgabe durch die Entwicklung von Verfahren zur Synthese von P(3HB/4HB)aus Essigsäureund Gammabutyrolacton mit Delftia acidovorans P4a gelöst. Delftiaacidovorans P4a ist aus Herbizid belastetem Mauerwerk isoliert worden(D. Hoffmann et al., 1996, Acta Biotechnol. 16: 121-131.) und zurmikrobiellen Dekontamination von mit Phenoxyessigsäure-Herbizidenbelasteten Materialien eingesetzt worden (R. Müller, W. Babel, D. Hoffmann, DE 19608 19 , EP 0881923 ). Es wurde gefunden, daß der StammCopolymere mit hohem Gehalt an 4HB aus Essigsäure und GBL synthetisierenkann. Fürdie Zellvermehrung wird Essigsäureals Kohlenstoffsubstrat genutzt; es werden keine zusätzlichenkomplexen Kohlenstoff und Stickstoffquellen (Malzextrakt und Polypepton)benötigt.Die Einleitung der PHA-Synthese ist somit einfach, durch Auszehrendes Ammonium-Stickstoff oder Phosphat zu vollziehen. Dadurch, sowiedurch preiswertere Kohlenstoffsubstrate können Prozeßkosten gespart werden. Eskönnendeutlich höherePHA-Gehalte mit einem hohen Anteil an 4HB erreicht werden. Überraschenderweisewurde gefunden, daß nurder Stamm Delftia acidovorans P4a zu dieser Copolymersynthese befähigt ist;in andere Isolate der Gattung Delftia (z. B Delftia acidovoransMC1 (Mülleret al., 1999, J. Microbiol. Res. 154: 241-246)) konnten keine Copolymereaus 3HB und 4HB nachgewiesen werden.
    [0009] Inder vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Produktion von P(3HB/4HB)aus Essigsäureund GBL mit gezielt einstellbarem 4HB-Gehalt beschrieben. Zur Zuführung derin höherenKonzentrationen toxischen Kohlenstoffsubstrate in das Fermentationsmediumwurden spezielle Fermentationsstrategien entwickelt. Mit diesenFermentationsstrategien werden konstante Verbrauchsraten der alsMischung zugeführtenKohlenstoffsubstrate erreicht und somit definierte Copolymeranteileerzeugt.
    [0010] Üblicherweisewerden Prozesse zur Synthese von PHB bei einem Überangebot an Kohlenstoffsubstratdurchgeführt.Die Produktbildung wird ausgelöst,wenn die Zellvermehrung durch Limitation eines Nährstoffes (bevorzugt Ammoniumoder Phosphat) begrenzt wird. Die Synthese von Copolymeren erfolgtdurch Zuführeneines zweiten Kohlenstoffsubstrates, welches als Precursor für den zweitenMonomerbestandteil dient. In dem hier beschriebenen Verfahren werdendie Kohlenstoffsubstrate in kleinen Konzentrationen kontinuierlichdosiert, um das Auftreten von inhibierenden Konzentrationen zu vermeiden.Für diePHA-Synthese wird ein Gemisch aus Essigsäure und Gammabutyrolacton imVerhältnis100 : 7 (v/v)) als Kohlenstoffsubstrat verwendet, welches semi-kontinuierlichin gleichbleibenden niedrigen Konzentrationen durch Kopplung andie pH-Regulation dosiert wird. Aufgrund der unterschiedlichen Verbrauchsratender beiden Kohlenstoffsubstrate können mit diesem System lediglichCopolymere mit einem molaren Anteil an 4HB von 10-13% reproduzierbarerzeugt werden. In der vorgeschalteten Wachstumsphase wird das Kohlenstoffsubstratin Form einer Mischung aus Essigsäure und Natriumacetat als Vorlagefür diepH-Regulation verwendet und auf diese Weise semi-kontinuierlichin nicht-toxischen Konzentrationen nachgeführt. Zum Erzielen hoher Bakterienkonzentrationenin der Fermentationsbrühewerden Spurensalze, und Ammonium oder Phosphat stufenweise oderkontinuierlich (durch Zusatz zum Kohlenstoffsubstratgemisch) nachgeführt.
    [0011] Ineiner bevorzugten Ausführungsformder Erfindung erfolgt die PHA Synthese in zweistufiger kontinuierlicherProzeßführung. DerartigeVerfahren, bei denen die Zellvermehrung und die Produktsynthesein getrennten Kulturgefäßen stattfinden,sind besonders geeignet, bei niedrigen Konzentrationen potentielltoxischer Kohlenstoffsubstrate eine gleichbleibende Zellvermehrungund eine hohe Produktanreicherung über einen beliebigen Zeitraumzu gestatten ( DE 19910143C2 ). Überraschendwurde gefunden, daß durchZufuhr von Kohlenstoffsubstratmischungen aus Essigsäure undGBL im Produktsynthesefermenter ein breites Spektrum von maßgeschneidertenPolymeren mit definierten und reproduzierbaren 4HB-Anteilen erzeugtwerden kann.
    [0012] Ineiner besonders bevorzugten Ausführungsformder Erfindung erfolgt die kontinuierliche Synthese von P(3HB/4HB)mit Delftia acidovorans P4a unter Belüftung und Rührung bei einem pH-Wert von7 – 9,5.Im ersten Fermenter erfolgt bei einer Verweilzeit von 2 bis 8 Stundendie Zellvermehrung unter C-Limitation bei Verwendung von Essigsäure und Natriumacetat.Die Medienzusammensetzung ist derart berechnet, daß kleineRestsubstratkonzentrationen von N von 0,04 bis 0,1 g/l in der Fermentationsbrühe vorhandensind. Die Fermentationsbrühe wirdkontinuierlich steril in ein zweites Fermentergefäß überführt, indem die Produktsynthese unter N-Limitation stattfindet. Im diesemFermenter werden Verweilzeiten von 8 bis 30 Stunden eingestellt.Als Kohlenstoffsubstrat werden Mischungen von Essigsäure undGBL, bzw. Essigsäureund Butandiol kontinuierlich zugeführt. Der Substratfluß wird soberechnet, daß nursehr kleine Restsubstratkonzentrationen im Medium auftreten. DerPHA-Gehalt der Zellen liegt zwischen 40 und 70% der Trockenmasse.In Abhängigkeitvon der Kohlenstoffsubstrat-Zusammensetzungim Medium können4HB-Anteile zwischen 2 und 20 mol% gezielt eingestellt werden. Dieräumliche Trennungvon Zellvermehrung und Produktsynthese erlaubt eine direkte Einflußnahme hinsichtlichdes zu erzeugenden 4HB-Gehaltes im Polymer.
    [0013] Ineiner weiteren Ausführungsformerfolgt die Synthese von P3HB/4HB in einstufiger kontinuierlicherFermentation im Chemostaten unter N- oder P-Limitation. Das Kohlenstoffsubstratwird als Mischung aus Essigsäureund Gammabutyrolacton im Verhältnis100 : 3 bis 100: 40 entweder mit dem Medium oder getrennt kontinuierlichzugeführt.Die Konzentration wird derart berechnet, daß hohe PHA-Gehalte erreichtwerden (40-70%) und Restkonzentrationen von maximal 0,5 g/l im Kulturmediumauftreten. Auch mit dieser Kultivierungsmethode sind Polymere mitdefinierten Copolymergehalt an 4HB zu erzeugen, wenngleich die Ausbeutewerteder aus GBL erzeugten 4HB-Anteile geringer sind.
    [0014] DieErfindung soll an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden,ohne sie darauf einzuschränken.
    [0015] Eswird der Stamm Delftia acidovorans P4a verwendet. Der Stamm wirdin einem 5 Liter fassenden Fermenter bei pH 7-9,5 (vorzugsweisepH 8,0) und 30°Cvermehrt. das Nährmediumhat folgende Zusammensetzung, 0.94 g/l (NH4)2SO4, 5.47 mg/l CaCl2 × 6H2O, 310 mg/l P (aus äquimolaren Konzentrationenan KH2PO4 und K2HPO4) und Spurensalze: MgSO4 × 7H2O (71.20 mg/l), CuSO4 × 5 H2O (0.78 mg/l), ZnCl2 × 7 H2O (0.44 mg/l), MnSO4 × 4 H2O (0.81 mg/l), Na2MoO4 × 2H2O (0.25 mg/l), FeSO4 × 7 H2O (10.0 mg/l). Das Volumen der Nährlösung beträgt 3,5 Liter;dieses wird mit 50 ml einer Vorkultur des Stammes beimpft. Die Kohlenstoffquellewird in Form von Natriumacetat × 3H2O (1,1 g/l) zugesetzt und als Säurevorlagefür diepH-Regulation, bestehend aus einem Gemisch von Natriumacetat × 3 H2O (360 g/l) und Essigsäure (104 g/l), kontinuierlich nachgeführt. NachVerbrauch des Ammonium-Stickstoffeswird Essigsäure-Mischunggegen eine Mischung folgender Zusammensetzung ausgetauscht: 340ml/l Essigsäure,11,9 ml/l Gammabutyrolacton, 511 ml/l 2N Schwefelsäure. Nacheiner Gesamtkultivierungszeit von 45 Stunden ist ein PHA-Gehaltvon 54% der Trockenmasse erreicht. Der 4HB-Anteil beträgt 13% (w/w)vom Gesamtpolymergehalt.
    [0016] DerStamm Delftia acidovorans P4a wird sowohl in einem 2-Liter als auchin einem 5 Liter fassenden Fermenter angezüchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben.Das Volumen der Nährlösung beträgt 0,8 bzw.3,0 Liter. Die Bakterien werden zunächst mit einer Mischung ausEssigsäureund Natriumacetat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert.Bei Eintritt der Wachstumslimitation durch Ammonium ist eine Bakterientrockenmassevon 1,0 g/l erreicht.
    [0017] DasVolumen im ersten Fermenter beträgt 0,8Liter, das Volumen des zweiten Fermenter 3,0 Liter. Nach Erreichender Stickstofflimitation werden im ersten Fermenter 1N Schwefelsäure und1N Natronlauge als Vorlage fürdie pH-Korrektur eingesetzt. Dann werden kontinuierlich 152 ml/hMedium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 unter Zusatzvon 33 g/l Essigsäureund 0,3 ml/l Silikon-Antischaumemulsion zugeführt. Das überzählige Kulturvolumen wird periodischabgepumpt. Der zweite Fermenter wird nach N-Limitation bis zum Erreicheneiner PHA-Konzentration von 30-40% (berechnet aus einer Eichkurveder Zunahme der optischen Dichte bei 700 nm) weiter als fed-batchbetrieben. Als Kohlenstoffsubstrat wird die Essigsäure-Natriumacetat Mischunggegen Essigsäure(200 g/l) ausgetauscht, fürdie pH-Korrekturgenutzt und somit kontinuierlich dosiert. Nach Erreichen des obengenannten PHB-Gehaltes werden 1NSchwefelsäureund 2N Natronlauge zur pH-Korrektur verwendet. Die beiden Fermentorenwerden verbunden, so daß dieZellen aus dem ersten Fermenter kontinuierlich steril in den zweitenFermenter überführt werden.Der Füllstand derFermenter wird konstant gehalten. Als Regelgröße dient die Fermentermasse.Das überzählige Kulturvolumenwird abgepumpt. Nach Erreichen des Gleichgewichtes hat das Kulturmediumdes ersten Fermenter eine Biomassekonzentration von 1,1 g/l (Trockenmasse)uns einen PHB-Gehalt von 0-1% (w/w). Das Kohlenstoffsubstrat wirdals Mischung aus Essigsäureund Gammabutyrolacton kontinuierlich dem zweiten Fermenter zugeführt. Miteiner Mischung aus 91 g/l Essigsäureund 11 g/l Gammabutyrolacton, die mit einer Geschwindigkeit von8,4 ml/Stunde zugepumpt wird, wird nach Erreichen des Gleichgewichtszustandeseine Biotrockenmassekonzentration von 2,6 g/l mit einem PHA-Gehaltvon 65% erreicht. Der 4HB-Anteilim Polymer beträgt6,8% (w/w). Die Verweilzeit der Zellen im zweiten Fermenter beträgt 20 Stunden.
    [0018] DerStamm Delftia acidovorans P4a wird in einem 2-Liter fassenden Fermenterangezüchtet,wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Nährmedium hat die 3-fache Konzentrationan Ammoniumsulfat, Spurensalzen und Kalziumchlorid, sowie 310 mg/lP (aus äquimolarenKonzentrationen von KH2PO4 und K2HPO4). Das Volumender Nährlösung beträgt 1,3 Liter.Die Bakterien werden zunächstmit einer Mischung aus Essigsäureund Natriumacetat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert.bei Eintritt der Wachstumslimitation durch Ammonium ist eine Bakterientrockenmassevon 5,3 g/l erreicht. Die Produktsynthese wird mit einer Mischung von340 ml/l Essigsäure,11,9 ml/l GBL, 511 ml/l 2N Schwefelsäure bis zum Erreichen einesPHA-Gehaltes von 30% der Trockenmasse unter fed-batch Bedingungenwie in Beispiel 1 durchgeführt.Der PHA-Gehalt wird anhand einer vorher ermittelten Eichkurve ausder Extinktion bei 700 nm errechnet. Dann wird die Fermentationals Chemostat weitergeführt.Es werden kontinuierlich 56 ml/h Medium, bestehend aus der dreifachenKonzentration an Ammoniumsulfat, Spurensalzen und Kalziumchlorid,310 mg/l P, 75 g/l Essigsäure,2 g/l GBL und 0,5 ml/l Silikon-Antischaumemulsion zugepumpt. DasKulturvolumen wird auf 1,31 eingestellt und die überzählige Fermenterbrühe periodischabgepumpt. Fürdie pH-Regelung werden 1N Schwefelsäure und 1N Natronlauge alsKorrekturmittel eingesetzt. Die Verweilzeit im Fermenter beträgt 23 Stunden.Im Gleichgewichtszustand wird eine Bakterientrockenmasse von 7,2g/l mit einem PHA-Gehalt von 38% erreicht. Der Anteil an 4HB beträgt 10,7%vom Gesamtpolymer
    权利要求:
    Claims (14)
    [1] Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Poly(D-3Hydroxybuttersäure-co-4-Hydroxybuttersäure) (P(3HB/4HB), dadurchgekennzeichnet, daß derStamm Delftia acidovorans P4a verwendet wird und durch spezielleKultivierungsverfahren mit mineralischen Medien und den KohlenstoffsubstratenEssigsäureund Gammabutyrolacton (GBL) oder Butandiol definierte 4HB-Gehalteim Polymer gezielt erzeugt werden können.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß dieZellvermehrung in mineralischem Medium, mit Essigsäure alsKohlenstoffsubstrat erfolgt.
    [3] Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet,daß dieKultivierung unter Belüftung undRührungbei 25-35 °Cund pH 7-9,5 erfolgt.
    [4] Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet,daß für die Produktsyntheseein Gemisch aus Essigsäureund Gammabutyrolacton oder Essigsäure und Butandiol verwendetwird.
    [5] Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet,daß dieZellvermehrung und Produktsynthese unter fed-batch Bedingungen erfolgen.
    [6] Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,daß dieKohlenstoffsubstrate semikontinuierlich, durch Kopplung an die pH-Regelungin kleinen Konzentrationen dosiert wird.
    [7] Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet,daß Wachstumund Produktsynthese im Chemostat erfolgen.
    [8] Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,daß dieKultivierung unter N- oder P-Limitation erfolgt.
    [9] Verfahren nach Anspruch 7-8, dadurch gekennzeichnet,daß dieMedien- und Kohlenstoffsubstrate so berechnet sind, daß kleineRestsubstratkonzentrationen (<0,5g/l) an Kohlenstoffsubstrat in der Kulturflüssigkeit auftreten.
    [10] Verfahren nach Anspruch 7 und 9, dadurch gekennzeichnet,daß Wachstumund Produktsynthese räumlichgetrennt in zwei Fermentoren erfolgen.
    [11] Verfahren nach Anspruch 7 und 9, dadurch gekennzeichnet,daß imersten Fermenter bei Verweilzeiten von 2-8 Stunden die Zellvermehrungunter C-Limitation mit Acetat erfolgt.
    [12] Verfahren nach Anspruch 7 und 9, dadurch gekennzeichnet,daß dieZellvermehrung im ersten Fermenter unter N- oder P-Limitation, jedochbei kleinen Restsubstratkonzentrationen an Acetat erfolgt.
    [13] Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,daß imersten Fermenter niedrige Restsubstratkonzetrationen an N oder Pauftreten.
    [14] Verfahren nach Anspruch 1-4 und 7-12, dadurch gekennzeichnetdaß dieProduktsynthese im zweiten Fermenter unter N- oder P-Limitationbei niedrigen Restsubstratkonzentrationen an Kohlenstoffsubstraterfolgt.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE102004030385B4|2008-02-07|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2006-01-19| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2008-07-31| 8364| No opposition during term of opposition|
    2011-04-21| 8339| Ceased/non-payment of the annual fee|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DE200410030385|DE102004030385B4|2004-06-23|2004-06-23|Verfahren zur Herstellung von Polydefinierter molarer Zusammensetzung mit Delftia acidovorans P4A|DE200410030385| DE102004030385B4|2004-06-23|2004-06-23|Verfahren zur Herstellung von Polydefinierter molarer Zusammensetzung mit Delftia acidovorans P4A|
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